细胞与分子免疫学杂志

细胞生长因子的纯化

 
T细胞生长因子的纯化‘吴易元杨艺张军(中国匡学斗学院肿瘤研究所免疫室,北京)陈慰峰(北京匡学院微生物及免疫学教研组?北京)’r细胞生长因子(简称TCGF或IL—2)的纯f1:,是了解T细胞活化的生物学基础,研究免疫调控,建立T细胞克隆株以及促进分子免疫学的发展所必需进行的工作。目前,国际上尚未获得完全均一的TCGF纯制品,其中主要的限制因素是产率太低,进行一次实验常需上万毫升的粗制剂”,i,,因而增加了工作的难度。为了研究细胞免疫的分子调节机理,探讨TCGF是单功能还是多功能,我们从一株能分泌TCGF的长臂猿细胞株MLAl44的培养上清中,用硫酸铵沉淀和柱层析法,试以小量的粗制品纯化TCGF,获得了具有活性的部份纯化的TCGF制剂,活力提高200倍左右。同时还用凝胶过滤法,测定了被纯化的TCGF的分子量。材料和方法一、MLAl44细胞株培养上;青液的产生MLAl44是一株长臂猿自发性淋巴肉瘤的细胞株,由美国Frederick癌症研究中心赠送。该细胞株能自发地分泌一种和人类TCGF相类似的因子。一般以4x,10~/ml细胞浓度经15%小牛血清的RPMll640培养液培养2—3天(37℃,5%C02)。细胞增殖至1—2X土0。/mI时,2,500rpm离心10分钟,收获上清(简称MLAl44-CM),保存在—20℃以下备用。二、TCGF活性的测定MLAl44-CM的TCGF活性测定,可用人的淋巴母细胞c3),也可用ConA:4)或PHA“’刺激小鼠胸腺细胞作靶细胞。由于小鼠胸腺细胞容易获得?所以我们采用了后者。方法简述如下:4—6周的C57BL/6/J、鼠,无菌取得胸腺,制备成单细胞悬液。以每孔10。/0.1ml的细胞浓度接种96孔平底培养板,再加PHA-M(DJfco)使终浓度为0.5%,最后加0.1ml不同稀释度的待测因子,同时傲PHA及不含TCGF的对照孔,使每孔总体积为0。2ml。培养板置37℃,5%COz孵箱中,经72小时收获。在收获前6小时,每孔加入。H—胸腺嘧啶核苷0.5aCi。收获的细胞用液体闪烁仪测定脉冲数,以参考闲子校正培养板间或不同实验批数的误差。三、纯化MLAl44-CMTCGF纯化是按Mier方法‘e,加以简化的,所有的步骤皆在4℃进行。纯化步骤如下:1.50%饱和硫酸铵沉淀(取上清);2.80%饱和硫酸铵沉淀(取沉淀);3.DEAE-Sephacel柱梯度洗脱'4.UltrogelAcA54凝胶过滤柱(第一次);5.UltrogelAcA54凝胶过滤柱(第二次)。(详见下图)750mlMLAl44—CM+1.固体硫酸苹至50男饱和度(边加边搅)静置90勺钟+。12,000rpmXl5分钟.喜2.上清加固牛硫酸铵至80弗饱和度(搅拌同—匕)12,000rpmXl5寸钟+。本工作由中国科宇院科学基金资近·22·+沉淀溶~20m1.pH7.80.02MTris缓冲液(含0.2mMPMSF)+T,is挣;·h:窄透析去睁晅酸铵3.DEAE—5ephacel柱(1.5X20cra)+::::号零㈠主:鹄。N。c,}各150ml梯度洗脱+收集活性蜂,测蛋白+浓缩,P2PBS透析十4.U1trogelAcA54柱(1.6X60cra)+收集活性峰,测蛋白+5.UItrogelAcA54柱(同上柱)+收集活性峰,测蛋白十以标准蛋白测分子量一、50%一80%饱和硫酸铵沉淀经硫酸铵沉淀后活性有明显丢失,回收率约?%,但杂蛋白去除率仅80%,因此比活图1DEAE—SePLacel洗脱图谱Fig.1DEAE—Sephacal eluciOn p,o门1es性(cpm/mg蛋白)反而下降。采用硫酸铵沉淀法作为初步浓缩蛋白的方法较为多见,因此法作用较温和。但也有用此法纯化淋巴因子存在严重失活现象”’的报导。二、DEAE—Sephacel梯度洗脱经DEAE—Sephacel洗脱的活性峰和蛋白峰并未分开(图1),说明比活性无明显提高,主要去除了一部份不被DEAE吸附的蛋白质。活性峰在75mMNaCI洗脱,和文献报导的结果一致。三、第一次UUrogelAcA54凝胶过滤由图2可见,经过第一次UUrogelAcA54凝胶过滤柱后,蛋白峰和活性峰得到了分离。此外,由于DEAE—Sephacel柱层析去除了某些对TCGF活性有抑制的物质,因而比活性有明显提高(约60倍)。图2斗UJtrogeIAcA54苹一止挺胶过滤柱图谱Fig.2Gel fjttrat,:onOn1s{UltrOSelAcA54.四、第二次UltrogelAcA54凝胶过滤再次通过UltrogelAcA54柱后,比活性又提高了4倍,因此总活性提高约200倍(图3)。·::,三,,争 i三 s;;;:::;;C己艺 j3兰+图3经Ultroge]AcA54第二次凝胶过虑柱图谱F心.3Ge真 filtr~tlon on2ndU1trogel—\cA54.整个纯化过程总结见下表。五、分子量测定用BlueDextran及VBl2测得柱体积,再以三种已知分子量的标准蛋白,即牛清蛋白(BSA,67KD)、糜蛋白酶原(Chymotry- pslnogen,25KD)及溶菌酶(Lysozyme,14KD)同样通过UltrogelAcA54柱后,计算出纯化的TCGF分子量为22—24KD。.23。国际上TCGF的纯化工作已进行了数年,至今尚未获得高度纯化的均一制品。目前绝大多数实验室均采用部份纯化的制品,但仍存在两个主要的限制因素:(1)产率极低。一般每1,000ml的TCGF-CM只能获得 l一10Pg较纯的制品。因此,一次实验需用上万毫升的TCGF-CM粗制品。(2)因子本身不稳定。我们发现MLAl44-CM在—20℃以下保存3个月后,活性有明显下降,而且在纯化过程中极易失活,纯化后的制剂也不稳定。目前我们尚无条件在短期内制备出大量粗制品。因此要获得一些比较纯的制剂,就必须摸索以小量MLAl44—CM纯化TCGF的方法。实验结果也证实了这种想法的可行性。关于部分纯化的方法甚多?有的很简÷单,只用一步法(硫酸铵沉淀或凝胶过滤柱层析),也有用等电点聚焦电泳(1EF)或高压液相层析法(HPLC)经过多步进行的。我们结合自己的具体条件,认为Mier的方法挚温和,有利于因子活性的稳定。但最后一步经聚丙烯酰胺电泳纯化后,纯化的倍数几乎没有提高,而活性却丢失十倍,产量下降十三倍,因此我们省略了这一步。在用小量粗制品纯化时,慎重地考虑因子的产率、活性及纯度三者的关系尤显重要。选用MLAl44—CM作为纯化TCGF的来源有以下优点;(1)该因子不但适于人也适于鼠的研究工作,(2)TCGF的因子由克隆表.从MLA-144—CM纯化TCGFTable.PurificationOfTCGF fromMLA—144 cell1ine,株所分泌,因此较鼠脾细胞或人周围淋巴细胞的来源纯度更高:(3)经济简便。纯化一次人的TCGF需用8,000m1周围血(获得4,000ml粗制品);如获得80鹧部份纯化的鼠TCGF,需用2,500只鼠的脾脏作为产生粗制品的来源,而获得长臂猿的TCGF只需培养液即可。因此以长臂猿作为获得TCGF-CM的来源,无疑是较理想的。测定分子量一般用两种方法,即聚丙烯酰胺电泳(SDS—PAGE)和凝胶过滤法。由于采用的方法不同,测得的结果也不完全相同。由于蛋白质具有聚集作用(Aggregat— ion),因此用凝胶过滤法测得的分子量较高‘¨。人的TCGF用SDS-PAGE测得为15KD左右,而用凝胶过滤法为22—25KD,在DEAE柱洗脱的活性峰为70mMNaCl。我们测得猿的TCGF分子量为22—24KD,DEAE洗脱峰为75mMNaCl。因此,猿和人的TCGF极为相似。采用750m1MLAl44—CM获得的纯化TCGF,粗略估计为1一lO,ug(参阅了数个实验室纯化的各种不同来源的TCGF的产率)。目前所纯化的制剂中仍混杂有0.0s%的小牛血清蛋白。如能改用无血清的培养液获得的MLAl44—CM作为纯化TCGF的来源,可望能进一步提高纯度。但TCGF在无血清中极不稳定,用无血清的培养液获得的纯化制品,其活力只能保持一周,因此必须加入少量(0.25%)的BSA才能匣活性稳定数月”,。因此,根据各种具体实验对TCGF纯度的要求,可试用各种纯化方法。参考文献1.Cra二e!㈠—P呻?r口OI, ct a1.J三\p\[cd1981:154:422.2.He:dersOnL£, cr a1.JImmunO:1983;131:810.:.灵易三。中华微生广学勺免疫主条亡198i年:+:69,4.谢大力.等.中华按苎物中和兔疫中杂丰(待发表)。;.FarrarJJ,et aI.JImmuOOl1978;121:1353.6.MierJ\Y andGa㈠oRC,JImmu:128:1122.7.Schwuler9U.㈠um9nL?mphOk;ne1982;S:.8.Ru5celr:FW, et a1.Biu!u小c引Rc5pOcse5 inCance,1982;l:121.9.MierJ\Y andGallORC.P/ocNar—\cad`9:1980:77:6134.Pu厂ificatiOnOfTCGF fromMLA一144CellLilieWuYl-yuanYangYiZhangJun(Cancer/natitute,ChineseAcademyO/MedicalSciencee,Bei//rig)ChenWel-feng(Bei/{n夕Med{caiCollege,Bei/ing)GibbOⅡTCGF has bee辽pur“ied approximately200 fO]d from aT1ymPhoma cell门neMLA一144 cOnditiOned media by usiⅡS ammonium sulfate precipitation,a sequeⅡceOf iOn exckaⅡge ehrO一皿atography withDEAE—Sephacel andZel filtrat{oⅡw“hUltrogeIAcA54.A molecu[af weight22-24KD has been estimated fromSel filLra“On studies.—\sOall amOu口tOf crudcTCGF p了epa— ra“On cOuld be partially puri[ied by this method.