0 引言 Introduction

目前对于关节软骨的再生修复仍是充满挑战性的科学难题，组织工程的快速发展使得软骨损伤的再生修复成为可能[1-2]。近年来越来越多的文献报道，免疫反应在组织再生过程中发挥着重要作用[3-7]，而巨噬细胞作为天然免疫系统中重要组成部分，其激活后的M2型巨噬细胞已被证实可促进组织的重塑和再生[5，8]。

巨噬细胞是一种具有很高可塑性和多能性的细胞群体，可以根据激活类型表现为2 种主要表型，具有明显不同的生物学功能。未激活的巨噬细胞称为M0型巨噬细胞，其特征性表面标志物包括CD14、CD68、F4/80(小鼠特有)[9-10]。经过初始刺激后巨噬细胞可获得不同的表型：M1型巨噬细胞是“经典激活”类型，特征性表面标志物为CD80、CD86，具有抗原提呈、分泌促炎性细胞因子和毒性介质的功能，从而达到杀灭细菌、病原体和肿瘤细胞的目的，但时常也会导致炎症反应的过度表达，造成组织细胞的损伤[9-12]；而M2型巨噬细胞称为“替代激活”巨噬细胞，特征性表面标志物为CD163、CD206，其主要的功能是分泌抗炎细胞因子，驱动免疫调节和促进伤口愈合及组织重塑[9，13]。激活后的巨噬细胞因表型不同而具有不同的功能，因此巨噬细胞和组织再生的关系较为复杂，表现为既可以促进组织再生又可以抑制组织再生，总体而言，M1型巨噬细胞主要参与炎症反应，不利于组织再生，而M2型巨噬细胞表现出可以抑制炎症，参与组织再生[14]。因此诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，从而通过调控局部免疫环境来促进组织再生，是目前组织工程领域常用的策略之一。

研究团队前期研究显示，脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix，ACECM)支架原位植入动物关节软骨缺损后可有效促进关节软骨缺损修复再生，具有良好的修复效果[15-16]，但其促再生机制尚未阐明。既往的相关研究主要关注ACECM 支架材料本身的物理特性(如：孔径、孔隙率、力学强度、可降解性等)及其保留的天然细胞外基质成分(如：胶原、糖胺多糖、生长因子及细胞因子等)对组织再生的影响，而关于软骨组织工程支架对免疫反应的调节研究较少，因此实验初步探索猪来源ACECM 支架材料对小鼠巨噬细胞表型的极化作用，为软骨组织工程支架材料促进组织再生提供新的研究思路。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 巨噬细胞极化体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年8 月至2019 年1 月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料 新鲜10 月龄猪关节20 个购自北京市屠宰场；RAW264.7 巨噬细胞系(ATCC 公司)；苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、 番红O 染色、天狼星红染色及DAPI 染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；死/活细胞染色试剂盒(Invitrogen公司)；HDMEM 细胞培养基(美国Sigma 公司)；胎牛血清(北京元亨金马生物科技有限公司)；单克隆抗CD68、单克隆抗CD86、单克隆抗CD206(美国Abcam 公司)；CO2培养箱Heraeus BB5060 型(德国 Heraeus 公司)；OlympusIX70 型倒置显微镜、BH-2 型生物显微镜、IX70 型荧光显微镜(日本东京 Olympus 公司)；超净工作台月坛双人水平层流型(北京半导体元件一厂)；S-4800 型扫描电镜(日本Hitachi 公司)；冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；Beckman Allegra X-22R 离心机(美国Beckman 公司)；TCS SP8 共聚焦显微镜(德国Leica 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 ACECM 支架的制备 具体方法参照实验室前期发表的文献制备ACECM 支架[17-18]，简而言之，取新鲜猪膝关节的软骨组织，通过湿法粉碎和差速离心制备纳米级不含细胞的猪软骨细胞外基质，然后通过冷冻干燥制备ACECM 支架。

1.4.2 ACECM 支架组织学染色 取ACECM 支架，OCT 包埋后进行冰冻切片(约7 μm 厚)，室温下丙酮固定30 min，备用。

苏木精-伊红染色：切片至水2 min，苏木精染液5-10 min，盐酸乙醇分化数秒，返蓝数秒，伊红染液30-60 s，常规脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察。

甲苯胺蓝染色：切片至水2 min，甲苯胺蓝染色液滴染15-20 min，流水稍冲洗，去除切片表面染液，常规脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察。

番红O 染色：切片至水2 min，番红O 染色液滴染15-20 min，流水稍冲洗，去除切片表面染液，常规脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察。

天狼星红染色：切片至水2 min，天狼星红染色液滴染15-20 min，流水稍冲洗，去除切片表面染液，常规脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察。