猪瘟病毒的分子免疫学研究进展猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属f1。]，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组大小约为12．3kb，含有1个大的开放读码框架(0RF)。它编码1个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白[3“54]，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞的酶作用，形成4个成熟的结构蛋白(C、E。、El、E2)以及至少7个非结构蛋白(P”、P”5、P7、P”、P”、P”、P75)[7’8]。各蛋白的基因排列顺序为：、P”／C／E。／El／E2／P7／P”5／P”／P30／P”／P”。猪瘟病毒可引起猪的急性、亚急性及慢性传染病。在自然条件下，猪是其唯一的易感动物。猪瘟能造成巨大的经济和贸易损失。由于猪瘟严重危害养猪业，人们试图通过各种途径来控制和消灭猪瘟。实践证明，猪瘟弱毒疫苗是安全有效的。但由于弱毒疫苗干扰猪瘟的血清诊断，使人们难以区别猪瘟感染猪和免疫猪，且不能使猪群处于无病毒状态等原因，欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用扑杀感染猪和猪瘟血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟。采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金投入，发展中国家更是难以承受，这些都促使人们研究和开发猪瘟的新型疫苗。近年来。基因工程技术的迅速发展为猪瘟新型疫苗的研究和开发提供了新的工具。猪瘟基因工程疫苗已成为新的研究方向。一个疫苗的成．败，最终是一个免疫学的问题。基因工程技术仅仅为懈决免疫学问题提供了新的手段，却不能解决免疫心力衰竭病畜，在发生肺水肿时禁用肾上腺素，改用‘0．1％异丙肾上腺素。在心率过快的重症急性心力衰竭病畜，可选用复方奎宁液，同时配合使用洋地黄帝廿荆，对减慢心率，效果更好。在严重的急性心力衰竭病畜，还可应用三磷酸腺苷、辅酶A、维生素Be等能源合剂。在病畜出现心率过快，伴有静脉淤血、水肿及／或体腔积水的慢性心力衰竭时，可选用洋地黄制剂。。在伴有全身性水肿的急慢性心力衰竭时，可选用安钠咖等咖啡因制剂。在病畜出现血管弛缓，脉搏微弱，心律失常，而呼吸困难和静脉淤血轻微，无水肿的急慢性心力衰竭时，可选用强尔心等樟脑制剂。2．3．5利尿剂的选择应用临床上为促进病畜排尿，减轻或消除水肿，可首选呋喃苯胺酸(速尿)，但因本药易引起电解质紊乱，故不宜常规应用。其它利尿剂，可选用氢氯噻嚓(双氢克尿塞)、水杨酸钠柯柯碱(利尿素)等．汞撤利和醋酸钾应用要慎重。2．3．6脱水剂的选择应用脱水剂主要用以降低颅内压、眼内压，首选甘露醇，其次选用山梨酵，尿素和50％葡萄糖降低颅内压、治疗脑水肿，效果不确实。脱水抻l不能明显地增加离子的排出量，故一般不作为利尿剂来消除全身性水肿。3药物配伍为了增强药物的疗效，减少注射次数。临床上常将几种注射渡混合应用，其中有些药物王宁朱燕张楚瑜(武汉大学生科院病毒系，)学的基础研究问题。开发、研制新型疫苗，首先要求人们对其免疫机制要有深入了解，这是开发新型疫苗的前提。目前，各国研究人员在猪瘟的免疫学研究方面做了许多工作，为猪瘟基因工程疫苗的研制提供了一定的理论依据。本文就猪瘟病毒分子免疫学作一概述。1猪瘟病毒的体液免疫猪瘟病毒的体液免疫反应已有了较为深入的研究。其中，中和抗体被认为是机体最重要的防御机制阳]。目前，已知E。(gp44／48)和E。(gpS5)可刺激机体产生中和抗体口““]，其中E。的中和抗体的作用强于E。的中和抗体。Rumenapf等_2j(1991)把猪瘟的结构蛋白基因插入痘苗病毒的tk基因，构建了3个重组痘苗病毒，即VAC core、VAC¨(core+E04-El4-E2)和VAC38。(core+Eo+E1+少部分E2)。VAC core和VAck8接种小鼠和猪．4周后，检测猪瘟病毒中和抗体．只有VAc。可引起鼠和猪产生中和抗体．VAC core却不能。分别用这3种重组痘苗病毒免疫猪1次，第4周用致死性强毒攻击(5×107TCID。。)。结果，VAC38免疫猪能抵抗强毒攻击，而接种VAC core和载体病毒的猪出现典型猪瘟变化，VAC。免疫猪仅在攻毒后第8天有热反应。但随后两天完全恢复。VAC一免疫猪虽具有抵抗强毒攻击能力，但它所免疫的猪未检出中和抗体。VanZijl等¨33利用缺失的伪狂犬弱间能发生物理性和化学性配伍禁忌，从而降低，甚至增强药物的毒性．必须予以注意。现就临必须注意的药物配伍问题阐述如下。1酸性药物注射液与碱性药物注射液混合时．中和反应，往往出现浑浊和沉淀，故禁止配伍。2洋地黄毒甙性质不稳定，易被酸、碱水解，故使用为好。3氮苄青霉素可与生理盐水或复方氯化钠注配伍，不可与5％葡萄糖或5％糖盐水配伍；先素和红霉素可与50A葡萄糖配伍，不可与生理或复方氯化钠注射液配伍。4氨苄青霉素不可与氯霉索配伍。5磺胺嘧啶钠注射液遇pH值较低的酸性溶析出沉淀．除可与生理盐水和20％甘露醇配。与多种药物均为配伍禁忌。6抗生素用于静脉注射时不可与维生素B-和素C注射液相配伍，以免降低药效。7镁制剂不可与钙制剂同时配伍静脉注射。85％碳酸氢钠除可与地塞米松配伍外·与袋药床发萱物均为配伍禁忌。96％右旋糖酐除可与10％氯化钾配伍外，与多药物均为配伍禁忌。 lO临床上在注射药物时．为了安全起见。最好养经常查看药物配伍禁忌表的习惯，对于最常用的物配伍禁忌一定要牢牢记住。射锋盐液伍维种之效上文生玉独玉液霉水王孓易外文生孓五药五种王成药中国兽医杂志1997年(第23卷)第4期毒疫苗作为载体，在gx缺失区插入猪瘟的E。基因构建了重组伪狂犬病毒M。。。(无转膜区)，M：。。(有1个转膜区)和M z。s(有3个转膜区)。分别用来免疫猪，检测免疫猪的中和抗体，其中，M：。免疫猪中和抗体滴度很低，仅能部分保护，而M：。M。。。可使机体产生很高滴度的中和抗体，能完全保护猪免予强毒攻击。Hulst等口43利用杆状病毒表达E：基因，经亲和层析纯化Ez，制成油乳剂免疫猪，不论免疫1次或2次，100LD”强毒攻击，所有免疫猪均得到保护，而对照猪死亡。Konig等[153采用Rumenapf等的方法，构建了6个重组痘苗病毒，分别为VAc。、VACN”。／C、VACEo、VACEl、VACE：、VACE。／2。各重组痘苗病毒所表达的猪瘟病毒蛋白与猪瘟病毒粒子本身相应的蛋白在SDS凝胶电泳中具有相同的电泳特征。将各组病毒分别免疫猪，4周后，检测痘苗病毒中和抗体，确认免疫有效后，分别采用两种不同的ELISA方法检测E。和E。的抗体，其中，VAcE。和VAC。的免疫猪可检出E。的抗体；所有能表达E。的重组痘苗病毒免疫猪都可检出E。的抗体，即VACE2、VACE1／2、VAC38，而VAcN”o／C、VACE1、VAC—WR免疫猪均为E。和E：抗体阴性。中和抗体检测结果是，只有表达E。的痘苗重组病毒能使机体产生中和抗体，而VACE。免疫猪未能检测到中和抗体。免疫5周后，用致死剂量的Alfort株攻毒，检查其保护效果。结果证明了Ez能引起机体产生中和抗体，产生对猪瘟的免疫力，这与上述几位研究者的结论一致，同时还首次发现E。也能使机体产生免疫力，获得免疫保护。虽然VACEo免疫猪未检测到中和抗体，但E。使机体获得免疫保护的机制仍是病毒中和抗体的作用。其原因主要是：1．1E。的单克隆抗体或E。特定抗体在细胞培养试验中能中和猪瘟病毒[1…。1．2E。的中和抗体滴度低，标准中和试验检测不到。1．3E。为可溶性糖蛋白，大量存在于细胞培养上清液中[1“。中和试验所用猪瘟病毒为病毒培养上清，存在于上清中的E。与E。的抗体结合，导致中和试验灵敏度降低。1．4E。上无猪瘟特异性CTL的抗原表位¨]。由上述结果可知，E。和Ez能使机体产生中和抗体，并能使机体获得免疫保护。而猪瘟的结构蛋白Core、E，(gp33)以及非结构蛋白N”。、P”5却不能产生中和抗体，且在猪瘟感染的猪中检测不到N”。、 core和E。的抗体[1“。虽然是猪瘟病毒的一个优势抗原，但其抗体并无中和作用。E。(gp55)是猪瘟病毒的主要囊膜糖蛋白．约370个氨基酸组成。E。在感染细胞和病毒粒子囊膜上以同源二聚体或与E。形成异源二聚体存在一“，并通过二硫键，使E：形成一定的空间结构。根据Ri— jn等[18,191研究发现，E2单抗表位位于其N端第690～866氨基酸之上。采用抗原俘获技术以及突变株分离分析等技术，证实E：分子上存在4个独特抗原结构域A、B、c、D。其中，A包括3个亚抗原结构域A，、A：、A。。A，与Az在猪瘟病毒中最为保守，A。、B、 c、D具有一定可变性。A。、B、C对诱导中和抗体具有重要意义。结构域A、B、c、D在E。的N端形成两个独立结构的单元。其一由B与C构成，另一个由A和D构成。其C端疏水性氨基酸片段作为E：的跨膜结构将E：牢固地固定于病毒囊膜上。此跨膜结构对E。的免疫原性具有重要作用E13]。含有完整E。基因(有跨膜结构)的重组伪狂犬病毒比不含跨膜结构的重组伪狂犬病毒产生中和抗体快，而且滴度高。原因尚不甚清楚。ED(gp44／48)也是猪瘟病毒囊膜的一个重要糖蛋白。E。每个单体由227个氨基酸组成。以同源二聚体的形式存在于感染细胞和病毒粒子囊膜上。由于E。无跨膜结构，故很容易从囊膜上脱落。在感染猪体的组织和血液以及培养上清液中有大量可溶性的E。存在。根据核酸序列比较分析，E。比Ez较保守，毒株问同源性较高。但是，目前Weiland和Akosmidou等00,z03制备的19个单克隆抗体没有1个能够在猪瘟病毒各毒株中检测到1个共同的抗原表位，也未发现与反刍动物瘟病毒有交叉反应，这都表明E。暴露于囊膜外的部分为其易变区。Eo具有RNA酶活性[21,2Z]。Windisch等n3]对Eo的中和单抗和非中和单抗对E。RNA酶活性的影响进行研究，在6个E。的中和单抗中有5个可显著地降低其RNA酶的活性。这一结果提示，E。的RNA酶活性在猪瘟病毒的繁殖过程中起着一定作用，它在致病过程中的作用还不清楚，是目前研究的焦点，这可能为猪瘟的防制和治疗开辟新的途径。2猪瘟病毒的细胞免疫学猪瘟病毒的细胞免疫学工作因猪T细胞检测困难及猪免疫系统较特殊等原因开展得较少。但随着人们不断发现许多病毒，如流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒感染中，细胞免疫，特别是CTL，发挥着非常重要的防御作用。因此，猪瘟病毒的细胞免疫学研究逐渐引起了人们的重视。Kimman等砼3]利用猪瘟病毒的Cedipest株免疫猪，Brescia攻毒．然后分离猪的外周血液单核细胞(PBMC)进行体外培养，用H3一胸腺嘧啶标记，测定抗原刺激指数(SI)，确定是否存在T细胞的特异性增生。其体外刺激所用抗原分别为活的猪瘟病毒Brescia2．1．1和紫外线灭活的猪瘟病毒。结果发现．活的猪瘟病毒可以引起猪的弱的T细胞体外增生，而灭活的猪瘟病毒却不能。T淋巴细胞增生反应严格地依赖于免疫剂量和时间。其免疫剂量与细胞增生性反应呈双峰式(bimodal)。增生性反应依赖于CD“CDSb,ig“’T细胞。但CD2+CD”也对猪瘟淋巴细胞增生性反应有一定的作用。在研究猪免疫及感染猪瘟病毒时的淋巴细胞增生性反应的动力学中，作者发现猪瘟免疫猪存在非抗原特异性的淋巴细胞增生，这一免疫现象可能掩盖特异性T淋巴细胞的增生反应。Kimman还采用伪狂犬病毒的NlA株构建了重组猪瘟病毒E。基因的伪狂犬病毒MzmM。。；和M：。。及利用重组杆状病毒表达Ez蛋白。经亲和层析纯化，获得了E。，分别用来做体外抗原刺激试验，结果为，经Cedipest免疫。Brescia攻毒