植物病原真菌抗药性的基因诊断和分子免疫学的利用倪长春编译作物栽培中需经常使用农药。，对于杀虫剂的抗性问题已为人们所熟知，但对植物病原菌的抗性问题则知之甚少。自发现抗性菌以来虽已有30余年，人们希望通过开发新药剂来解决，但植物病原菌仍然相继产生抗性菌。为了控制由二f抗性菌所造成的危害，科技人员正积极设法采用基因方法来快速诊断抗性菌，以期能有效地选择防治药剂。抗性菌问题将持续到何时最早使用的有机汞杀菌剂，虽因水俣病等环境问题早已被禁用，但此类药剂在农业上几乎从未听到过有关抗性问题。以后，人们要求开发安全的杀菌剂，但抗性问题却一直困扰着人们，(表1)即为日本发现的代表性抗性菌例。由于要进行毒性及环境影响等有关试验，目前开发一个新农药需耗用上亿美元。可是研发出来的新农药，往往使用几年后即出现抗性，导致防效降低，此类事例并不少见。追溯其因，就杀菌剂而言，由于人们希望筛选出的化合物对病原菌具有较高的防治效果，又要求对人畜及其他生物无影响(就是说要高选择毒性)，于是不得不使药剂所针对的靶标位点变得极端狭窄。在所使用农药中，虽也有一些作用机理不明的药剂，但很多大型农药产品为具特异作用点的药剂。其中，如药剂靶标位点(多数为蛋白质)的编码基因稍有变异，就会使氨基酸发生变化，这样药剂就难以与靶标位点结合，从而失去作用。如果这种变异菌株能适应环境生存的话，那么使用此药剂时会使选择压增强，抗药性也就提高，这样药剂就会失去防治作用。由此可见，只要所开发的杀菌剂为直接作用于病原菌的药剂，尤其是具有特异作用点的的抑制剂，今后仍将不可避免地产生抗性。表1日本田问抗性菌的发生例(仅为代表性)药剂病原蔼多氧霉素春日霉素苯并咪唑类有机磷类二羧亚胺类链霉素。苯酰胺类甾醇脱甲基化抑制剂氟啶胺喹菌酮甲氧基丙烯酸类小柱孢酮脱氢酶抑制型黑色素合成抑制剂梨黑斑病菌、苹果斑点落叶病菌水稻稻瘟病菌、水稻褐条病菌各种作物灰霉病菌、果树黑星病菌、果树灰星病菌、茶炭疽病菌、稻恶苗病菌、小麦网纹病菌、小麦赤霉病菌、大豆紫斑病菌、洋葱灰腐病菌、草莓炭疽病菌、柑橘疮痂病菌、葡萄黑痘病菌水稻稻瘟病菌各种作物灰霉病菌、梨黑星病菌桃细菌性穿孔病菌、黄瓜角斑病菌黄瓜霜霉病菌、马铃薯晚疫病菌黄瓜白粉病菌、小麦白粉病菌、草莓白粉病菌、茄煤污病菌豆类灰霉病菌水稻细菌性谷枯病菌、水稻褐条病菌黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、茄煤污病菌、黄瓜褐斑病菌、草莓炭疽病菌水稻稻瘟病菌‘2’世界农药第28卷一========!====：=：==：==!======：==================：：一一抗性茵是如何形成的自使用杀菌剂防治病害以来，原先对药剂敏感性较高的病原菌，仅在未喷洒到药剂的野生型菌群中，由于突变，会产生敏感性较差的菌株和少量的抗性菌。但是，随着田间和温室、大棚中抗性菌的不断增加，从两替代了敏感菌，以致于药剂失去了防治效果，导致病害大发生。另外，也没有对所有病原菌均有效的万能药剂，因此那些原本对药剂非敏感或低敏感性的菌，由于使用了新开发的药剂使药剂针对的主要病原菌受到了控制，减少了发生，但一些次要病原菌则突然暴发。此种现象并不见怪，这反映了农业微生物生态体系可塑性的一个侧面。田间抗药性的发展有时快得惊人，有时候药剂使用了仅1—2年就因为抗性增加造成损失。这是由于原先比例较低的潜在抗性菌，因药剂的选择作用而显著增加所致。当然，也必然会存在目前所难以阐明的原因，例如说由于药剂的选择压，使抗性变异率增加；或认为由于转座因子那样的可动因子的参与所致等，但是在植物病原菌中却尚无可证实这些观点的例子。是否需加强药剂的结构变化杀菌剂一个主要的解毒机理与众人所知的杀虫剂的抗药性不同。从田问采集的植物病原菌中，由解毒产生抗药性的例子极少。人们还是按照以前所说的那样，很多情况下是由于药剂作用点的蛋白质基因突变而产生抗性。符合这些抗药性机理的药剂，除了已进行了很多研究及积累的苯并咪唑类外，也有近年开发的在世界杀菌剂市场中占有重要地位的甲氧基丙烯酸类(即辅酶Q抑制剂QoI剂)。此外，尚有用于水稻稻瘟病的抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂等。4．甲氧基丙烯酸类药剂(辅酶Q抑制剂，QoI剂)以担子菌产生的抗生物质StrobilurinA为先导，通过化学合成的方法，合成了一系列基本化学结构不同但具有相同作用机理的一类药剂。此类药剂对卵菌、子囊菌、担子菌、半知菌等具有广谱的抗菌活性，对病害有卓越的防治效果而且在土壤中分解较快，认为是一类对环境影响小的药剂。为此，世界众多农药公司均进行此类药剂的研究开发，并已有不少商品上市，如嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌艘、肟菌酯等。甲氧基丙烯酸类杀菌剂是一类呼吸作用抑制剂，其作用机理完全不同于以前的多作用点抑制型药剂。甲氧基丙烯酸类杀菌剂可与病原菌线粒体电子传递中被称为复合体Ⅲ细胞色素bc，蛋白质分子的Q0部位相结合，从而阻断呼吸途径，影响册能量合成。可是，细胞色素b基因较之细胞核DNA容易变异的线粒体DNA上的编码，其缺乏成功经验，故造成了抗性菌的迅速发展。并且表现出比敏感菌高1000倍甚至更高的高抗水平，以致喷施常规浓度药剂也无效果。将瓜类白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、茄子煤污病菌、黄瓜褐斑病菌等细胞色素b基因的一部分用PCR扩增，再从碱基排序来推测氨基酸，可发现密码子143部位敏感菌株为甘氨酸，而在抗性菌株中则被取代为丙氨酸(图1)。由(图1)可见，该变异位点(G143A)即为甲氧基丙烯酸类药剂与细胞色素b的重要结合位点。由此可认为，该位点仅仅被甘氨酸分子稍大的丙氨酸所取代后，使其与药物结合的亲和力下降。另外，密码子129位氨基酸由苯丙氨酸取代亮氨酸(F129L)后的甲氧基丙烯酸类杀菌剂抗性菌，它们的耐药水平并不高。为了探讨变异所造成的影响，日本的石井英夫曾在酵母细胞色素b基团中转录入变异体，制取了替代氨基酸的重组体进行了试验。结果发现Y136W、H141F、L275F那些同时由3个氨基酸取代的重组体，其细胞色素b的含量最低。与此相反，从田间采集的植物病原菌分离的菌株中发现产生G143A和F129L的变异体中，其细胞色素b的含量和细胞包素c还原酶的活性均无太多影响。对于考察基因变异和适应能力的关系颇有价值。在由其他部位发生变异而导致机能和适应性降低的菌株，还未发现抗性菌，认为它们在农业生态体系可能已遭淘汰。第3期倪长春：植物病原真菌抗药性的基因诊断和分子免疫学的利用‘3’瓜类白粉病抗性菌R一2：敏感菌K．7．2：甜瓜l：黄瓜霜霉病抗性菌R：敏感菌S：黄瓜褐斑病抗性菌AKE-3敏感菌c9573茄子煤污病抗性菌K一1：敏感菌T．1：F—MGYGLP—WGGMS—FW—AATVFLGYGI．I’YGQM￡．LWGATVFLGYGI．PYGQMLLWGATVFMGYV l，PWGQMSFW—AATVFMGYVI．PWGQMSFWGATVF丛GYVI。t’一WGQMS—FW—AATVFLGYVL l’YGQMSLWGATVFLGY gL t’YGQMSLW—AATVFLGYVLPYGQMSLWGATV图l瓜类白粉病、黄瓜霜霉病、黄瓜褐斑病及茄子煤污病在甲氧基丙烯酸类杀菌剂的抗性与敏感性菌中，由细胞色素b所推断出的氨基酸排序图(密码子129～146)在抗性菌排序中，字母底部有下划线者为氨基酸取代位点研究，并已发现其主要作用机理是在药剂作用位点5．小柱孢酮脱氢酶抑制型黑色素合成小柱孢酮脱氢酶基因上有一个碱基发生变异(密码抑制剂(MBI．D剂)子75部位的GrI'G--+ATG)，也就是缬氨酸被取代为蛋氨酸，由此使其与药剂相结合的活性下降。据世晃经济合作与发展组织(OECD)在2002年报道，单位面积中农药用量最高的为日本，而在日本尤以水稻上用药为最。近年以来，日本在水稻移栽前于育苗箱中推广长效杀菌剂，其为减少稻瘟病及其他病害的防治次数和节省劳力作出了很大贡献。可是在最近，出现了用于育苗箱中环丙酰菌胺(carpropamid)抗性菌，以致使该药剂对稻瘟病的防效下降。而此抗性菌对双氯氰菌胺(diclocymet)和氰菌胺(fenoxanil)等其他抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂之间具交互抗性。稻瘟病菌在向水稻体内侵入时，会产生具黑色素的附着器，而不产生黑色素的白化菌株就无侵人功能，这样的菌无致病性。黑色素合成抑制剂中，属还原酶抑制型(MBI．R剂)的三环唑、咯喹酮、四氯苯酞等已沿用了30余年，但均未发现有抗性菌发生。可是近年来抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素抑制剂抗性菌的发生和发展，对人们确是一个沉重的打击。当探明稻瘟病菌对抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素抑制剂的抗性机理，相关农药公司很快着手进行为何必须要实施基因诊断进行一些PCR之类的基因实验，仍是当今的流行之举，但往往缺乏应用依据，进行基因诊断就应有原因。在抗性菌测定中，通常要制备加有药剂的培养基，随后观察菌丝体生长或孢子萌发情况，以及萌发芽管的伸长情况。而在用药剂处理过的植物体上接种病原菌时，尚需调查发病情况。但此法对不少药剂和病原菌并不适宜。例如甲氨基丙烯酸类杀菌剂的抗性菌，首先发生在人工培养基上无法培养的专性寄生菌黄瓜和甜瓜白粉病，以及黄瓜霜霉病上，故而抗性的测定就必须采用盆栽植物或植物叶片等。另外，茄子煤污病菌虽可在人工培养基上进行培养，但生长十分缓慢，要获得检定结果就要花相当的时间。不仅如此，甲氧基丙烯酸类杀菌剂虽可阻断电子传递链中的主要呼吸途径，但对于不少真菌而言，由于要诱导交替氧化酶(ahemative oxidase)产活，而在普通培养基上抑世界农药第28卷制菌丝生长的作用较弱，因此生长于培养基上的菌就难以判断是对甲氧基丙烯酸类杀菌剂敏感的还是抗性的菌。就抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂而言，由于其能抑制稻瘟病菌黑色素的合成，故可根据菌落着色变化程度作为指标进行检定，但精确度较低。而每次准备稻苗，用病原菌接种进行试验的方法，则更难以知晓药剂的抗药性了。此法难以满足当今对病原体鉴定、抗性菌诊断的准确、快速、简便的要求了。7．可实际应用的抗性菌的基因诊断当对药剂的防治效果产生疑问时，从预防为主的角度出发，应该尽早开展抗性分布状况的监测，并制订相应的防治策略就至关重要。以前的抗性菌基因诊断仅停留在研究上，而今则能在农业上广泛应用了。(表2)汇总了抗性菌基因诊断中各阶段的研究方法，可供参考。，另外也可参考Et本石井英夫在2002年抗性菌基因诊断的有关综述(石井贡文，“Agn)chemicaResistance”，Amer．Chem．Soc．，2002， p242)。7．1甲氧基丙烯酸类杀菌剂(辅酶Q抑制剂)最早对甲氧基丙烯酸类杀菌剂产生抗性系在德国等西欧各国，发现其在小麦白粉病防治中效果下降，并发现了抗性菌株。在这些国家中，早就广泛开展对原先使用的鲻醇脱甲基化抑制剂的抗性菌的监测工作。他们曾用装在汽车上的空气捕集器来捕集由气流传播的白粉病菌孢子。目前进一步用于甲氧基丙烯酸类抗性菌的监测。同时，还将小麦上重大病害——小麦叶枯病菌等也作为监测对象，与白粉病一样进行监测。表2抗性菌的基因诊断方法第3期倪艮春：植物病原真菌抗药性的基因诊断和分子免疫学的利用监测中经常采用等位基因特异性耐热型探针(TaqMan探针)，以实日寸PCR法进行测定。鉴于细胞色素b密码子143位点氨基酸在甲氧基丙烯酸类杀菌剂的抗性菌为丙氨酸，而在敏感菌中则为甘氨酸，故可分别将编码氨基酸的碱基GCT和GGT制成互补排列的探针，再将各个5’．末端用FAM和VIC等不同萤光应答色素作好标记，同时，在3’一末端用消光物质作标记。TaqMan探针在特异性排列的DNA模板上进行杂交，由PCR引物产生延长反应。此时，已杂交的TaqMan探针可将具57核酸酶活性的TaqDNA聚合酶切断，致使应答色素不受消光物质的影响而发生萤光。如果能计算出FAM和VIC信号的比例，就可得知等位基因的抗性变频度。如后所述那样，了解了细胞色素b中抗性变异型等位基因和野生型等位置基因的比例关系，对探讨甲氧基丙抗性菌：··敏感菌：一烯酸类杀菌剂的抗性具有重大的意义。此外，石井英夫等在甲氧基丙烯酸类杀菌剂的抗性基因诊断中还采用了PCR，RFLP法。因为此法无需昂贵的器械，并已在众多农业试验场中应用。由于细胞色素b基因的变异，在抗性菌中，密码子由143转到144位，于是就会产生在敏感菌中未有的 hal限制酶的识别位点(GCNGC)。因此可将包含有此范围的基因片断用PCR扩增，随后进一步用酶处理反应液，再进行电泳。如果电泳中发现被断开，就可判断为抗性菌(图2)。在甲氧基丙烯酸类杀菌剂抗性菌的基因诊断中，除目前所用的上述方法外，还采用了分子信号标示法(molecular beacon法)和采用等位基因特异引物的ASPCR法(allele．specificPCR法)等。图2黄瓜霜霉病菌对甲氧基丙烯酸类杀菌剂抗性菌和敏感菌在细胞色素b基因中部分碱基序列(底部划线部分相当于细胞色素b密码子143的氨基酸。在抗性菌中看到点突变，用ha／限制酶处理，就可识别点突变部位)7．2抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂(MBI．D剂)的抗性由于小柱孢酮脱氢酶基因的点突变在密码75位处，使蛋氨酸(V75M)取代缬氨酸，此为对抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂产生抗性的主要原因。由此可从稻瘟病菌的培养菌体中，或从罹病水稻叶中提取染色体组DNA作为模板，用PCR法来扩增小柱孢酮脱氢酶基因，进而用踟NI限制酶进行酶切处理，如能被切断，就可判定为抗性菌。由于此限制酶十分昂贵，现采用稍为廉价的XbaI酶，并用PIRA—PCR(primer—introduced restriction enzyme analysisPCR)法来诊断抗药性。在日本，抑制小柱孢酮的黑色素合成抑制剂已在水稻栽培体系中占有重要地位，另外，对于稻瘟病而言，众多农药公司采用PIRA—PCR方法进行了诊断。结果发现，在日本众多地区均发现了此类药剂的抗性菌。为了避免损失，要求使用不同作用机理的替代药剂，或以其他药剂与抑制小柱孢酮的黑色素合成抑制剂产替使用。对于抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂的抗性诊断，除采用上述方法外，也可用单链DNA构象多态性的方法(SSCP，single．strandDNA corfformation polymorphism)进行诊断。此为由于具热变性单链DNA的高级结构会随着碱基变异而发生变化，对此可利用电泳过程中在硅胶上移动时间不同来判断。石井英夫曾用此方法对除梨黑星病外的病原菌对苯并咪唑类药剂的抗性进行诊断。最近石井等开始采用PCR—Luminex的方法进行抗性诊断，现正用于对抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂的抗性诊断，(图3)即为此法的概要。在此法中采用96穴板。由于能快速解析板上多个检测样本中单核苷酸多态性SNP(single nucleotide polymorphism，1碱基多态现象)，因此通过点突变不仅能诊断抗性菌，而且可广泛用于其他方面。例如，由小麦赤霉病菌引起麦粒上单端孢霉类真菌毒素，尤其是目前已成问题的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)GG铲篓GGAAGGGGl专第3期乔依：新颖3，4，7一三位取代香豆素化合物的合成和杀菌活性化合物ii|衍生物的生物活性同样还取决于7位的取代基的长度，带有2个苯环的衍生物，如化合物(6)和(7)，比那些只有一个取代环的化合物[如化合物(4)]的生物活性要强。进而，选择的8个具有抑制活性的香豆素(2～9)还测定了对其他4个植物病原真菌(炭疽病、苹果轮斑病、灰疫病和稻瘟病)的生物活性。结果也在(表2)中例示。在所有测试的香豆素中，化合物(9)对上述病原菌的活性最好，但它对这些病原菌尤其是对炭疽病的活性不如对灰霉病的活性。其他化合物的情况，同样的，除了化合物(8)对苹果轮斑病的抑制作用之外，相比抑制灰霉病来说，需要更高浓度的化合物才能抑制其他3个病原真菌。已有报导指出0．乙氧甲基一N一[2．(4．三氟甲氧苯基)乙基]水杨酸胺显示出很强的活性。但(上接第6页)变化的现象。业已得知，此系某种蛋白质的作用所致。此外，还必须对所产生的变异型细胞色素b基因的比例予以定量。拷贝数颇多的线粒体DNA中极小部分，即使仅有5～10％为变异型，用Ital限铡酶进行酶切处理后，再进行电泳时，在使用常用的溴乙啶染色的情况下，变异型DNA的含量不到10％左右是不能检测出来的。可是，在引物一边用若丹明作萤光标记进行PCR操作，再将产物用Ital酶切处理后，用萤光图象分析仪进行解析时，变异型DNA含量只要在1％时即可检出。就对抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂具抗性的稻瘟病菌而言，在田问去除了药剂选择压后，其抗性程度是降还是未降，至今尚不清楚。将抗性菌每两周在不加药剂的培养基中进行传代培育后，测定小柱孢酮脱氢酶基因的排序，结果经过了24代培养也未观察到基因序列有任何变化。另外，在一70℃下保存的稻瘟病抗性菌，常常于稻苗上进行药效试验，至少历经了14个月，抗性依然保持。更富有趣味的在早年刚进行抗性菌调查时，抗性菌检出率达100％，而当大范围停止使用抑制小柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂后的第二年，抗性菌是化合物(8)和(vi)，同样也具有乙氧甲基一N一[2一(4。三氟甲氧苯基)乙基]水杨酸胺的基团，只有很低的活性!。比较化合物(4)和(8)的活性，结果表明氨基键直接连接到香豆素部分的化合物减少了对所有测试菌的活性。尽管化合物(6)只对灰霉病具有显著的抑制效果，但它的结构相似衍生物化合物(7)，具有更广谱的抗真菌活性。对于稻瘟病的情况，化合物(2)是最能够抑制其萌发的。有趣的是，这一活性强于对灰霉病孢子的防治活性。总的来说，科研人员最终选择了化合物(9)作为一个新杀菌剂的先导，该化合物是模板化合物(1)的7位取代的优化产物。然而，为了达到田闻应用的水平，还需要通过进一步优化更多的化合物以增加活性。检出率为60。80％，二年后锐减到5～10％。由于稻瘟病菌孢子是通过气流传播的，因此在田间，敏感菌的飞入也会对抗性菌起到稀释的作用(当然也有相反的情况)。在使用抑N4'柱孢酮脱氢酶的黑色素合成抑制剂时，随着抗性菌种子的流通，会导致抗性菌广泛传播的问题。对此，有人利用观察稻瘟病菌中可动因子Pot2的DNA酶解图谱进行解释，由此，正在逐步弄清抗性菌产生的背景和动态。跟踪农产品在生产、流通领域等的情况，是目前大家经常谈及的活题。，同样在水稻生产中，进行种子的抗性菌基因诊断也将成为人们研究的课题。9．结语阐明抗性菌在农业生态体系中的动态，分子免疫学法是极为有效的方法。但是，为将抗性监测结果在现场中有效地应用，则应开发高通量诊断技术并迅速公布结果，并拿出切实的方案且公开于众。对此，就要求有关农业科技工作者群策群力，齐心合力解决杀菌剂的抗性问题，这是广大农药工作者和农民所期望的。