T细胞生长因子的纯化‘吴易元杨艺张军(中国匡学斗学院肿瘤研究所免疫室，北京)陈慰峰(北京匡学院微生物及免疫学教研组?北京)’r细胞生长因子(简称TCGF或IL—2)的纯f1：，是了解T细胞活化的生物学基础，研究免疫调控，建立T细胞克隆株以及促进分子免疫学的发展所必需进行的工作。目前，国际上尚未获得完全均一的TCGF纯制品，其中主要的限制因素是产率太低，进行一次实验常需上万毫升的粗制剂”，i，，因而增加了工作的难度。为了研究细胞免疫的分子调节机理，探讨TCGF是单功能还是多功能，我们从一株能分泌TCGF的长臂猿细胞株MLAl44的培养上清中，用硫酸铵沉淀和柱层析法，试以小量的粗制品纯化TCGF，获得了具有活性的部份纯化的TCGF制剂，活力提高200倍左右。同时还用凝胶过滤法，测定了被纯化的TCGF的分子量。材料和方法一、MLAl44细胞株培养上；青液的产生MLAl44是一株长臂猿自发性淋巴肉瘤的细胞株，由美国Frederick癌症研究中心赠送。该细胞株能自发地分泌一种和人类TCGF相类似的因子。一般以4x,10~／ml细胞浓度经15％小牛血清的RPMll640培养液培养2—3天(37℃，5％C02)。细胞增殖至1—2X土0。／mI时，2，500rpm离心10分钟，收获上清(简称MLAl44-CM)，保存在—20℃以下备用。二、TCGF活性的测定MLAl44-CM的TCGF活性测定，可用人的淋巴母细胞c3)，也可用ConA：4)或PHA“’刺激小鼠胸腺细胞作靶细胞。由于小鼠胸腺细胞容易获得?所以我们采用了后者。方法简述如下：4—6周的C57BL／6／J、鼠，无菌取得胸腺，制备成单细胞悬液。以每孔10。／0．1ml的细胞浓度接种96孔平底培养板，再加PHA-M(DJfco)使终浓度为0．5％，最后加0．1ml不同稀释度的待测因子，同时傲PHA及不含TCGF的对照孔，使每孔总体积为0。2ml。培养板置37℃，5％COz孵箱中，经72小时收获。在收获前6小时，每孔加入。H—胸腺嘧啶核苷0．5aCi。收获的细胞用液体闪烁仪测定脉冲数，以参考闲子校正培养板间或不同实验批数的误差。三、纯化MLAl44-CMTCGF纯化是按Mier方法‘e，加以简化的，所有的步骤皆在4℃进行。纯化步骤如下：1．50％饱和硫酸铵沉淀(取上清)；2．80％饱和硫酸铵沉淀(取沉淀)；3．DEAE-Sephacel柱梯度洗脱'4．UltrogelAcA54凝胶过滤柱(第一次)；5．UltrogelAcA54凝胶过滤柱(第二次)。(详见下图)750mlMLAl44—CM+1．固体硫酸苹至50男饱和度(边加边搅)静置90勺钟+。12，000rpmXl5分钟．喜2．上清加固牛硫酸铵至80弗饱和度(搅拌同—匕)12，000rpmXl5寸钟+。本工作由中国科宇院科学基金资近·22·+沉淀溶~20m1．pH7．80．02MTris缓冲液(含0．2mMPMSF)+T，is挣；·h：窄透析去睁晅酸铵3．DEAE—5ephacel柱(1．5X20cra)+：：：：号零㈠主：鹄。N。c，}各150ml梯度洗脱+收集活性蜂，测蛋白+浓缩，P2PBS透析十4．U1trogelAcA54柱(1．6X60cra)+收集活性峰，测蛋白+5．UItrogelAcA54柱(同上柱)+收集活性峰，测蛋白十以标准蛋白测分子量一、50％一80％饱和硫酸铵沉淀经硫酸铵沉淀后活性有明显丢失，回收率约?％，但杂蛋白去除率仅80％，因此比活图1DEAE—SePLacel洗脱图谱Fig．1DEAE—Sephacal eluciOn p，o门1es性(cpm／mg蛋白)反而下降。采用硫酸铵沉淀法作为初步浓缩蛋白的方法较为多见，因此法作用较温和。但也有用此法纯化淋巴因子存在严重失活现象”’的报导。二、DEAE—Sephacel梯度洗脱经DEAE—Sephacel洗脱的活性峰和蛋白峰并未分开(图1)，说明比活性无明显提高，主要去除了一部份不被DEAE吸附的蛋白质。活性峰在75mMNaCI洗脱，和文献报导的结果一致。三、第一次UUrogelAcA54凝胶过滤由图2可见，经过第一次UUrogelAcA54凝胶过滤柱后，蛋白峰和活性峰得到了分离。此外，由于DEAE—Sephacel柱层析去除了某些对TCGF活性有抑制的物质，因而比活性有明显提高(约60倍)。图2斗UJtrogeIAcA54苹一止挺胶过滤柱图谱Fig．2Gel fjttrat,：onOn1s{UltrOSelAcA54．四、第二次UltrogelAcA54凝胶过滤再次通过UltrogelAcA54柱后，比活性又提高了4倍，因此总活性提高约200倍(图3)。·：：，三，，争 i三 s；；；：：：；；C己艺 j3兰+图3经Ultroge]AcA54第二次凝胶过虑柱图谱F心．3Ge真 filtr~tlon on2ndU1trogel—＼cA54．整个纯化过程总结见下表。五、分子量测定用BlueDextran及VBl2测得柱体积，再以三种已知分子量的标准蛋白，即牛清蛋白(BSA，67KD)、糜蛋白酶原(Chymotry- pslnogen，25KD)及溶菌酶(Lysozyme，14KD)同样通过UltrogelAcA54柱后，计算出纯化的TCGF分子量为22—24KD。．23。国际上TCGF的纯化工作已进行了数年，至今尚未获得高度纯化的均一制品。目前绝大多数实验室均采用部份纯化的制品，但仍存在两个主要的限制因素：(1)产率极低。一般每1，000ml的TCGF-CM只能获得 l一10Pg较纯的制品。因此，一次实验需用上万毫升的TCGF-CM粗制品。(2)因子本身不稳定。我们发现MLAl44-CM在—20℃以下保存3个月后，活性有明显下降，而且在纯化过程中极易失活，纯化后的制剂也不稳定。目前我们尚无条件在短期内制备出大量粗制品。因此要获得一些比较纯的制剂，就必须摸索以小量MLAl44—CM纯化TCGF的方法。实验结果也证实了这种想法的可行性。关于部分纯化的方法甚多?有的很简÷单，只用一步法(硫酸铵沉淀或凝胶过滤柱层析)，也有用等电点聚焦电泳(1EF)或高压液相层析法(HPLC)经过多步进行的。我们结合自己的具体条件，认为Mier的方法挚温和，有利于因子活性的稳定。但最后一步经聚丙烯酰胺电泳纯化后，纯化的倍数几乎没有提高，而活性却丢失十倍，产量下降十三倍，因此我们省略了这一步。在用小量粗制品纯化时，慎重地考虑因子的产率、活性及纯度三者的关系尤显重要。选用MLAl44—CM作为纯化TCGF的来源有以下优点；(1)该因子不但适于人也适于鼠的研究工作，(2)TCGF的因子由克隆表．从MLA-144—CM纯化TCGFTable．PurificationOfTCGF fromMLA—144 cell1ine，株所分泌，因此较鼠脾细胞或人周围淋巴细胞的来源纯度更高：(3)经济简便。纯化一次人的TCGF需用8，000m1周围血(获得4，000ml粗制品)；如获得80鹧部份纯化的鼠TCGF，需用2，500只鼠的脾脏作为产生粗制品的来源，而获得长臂猿的TCGF只需培养液即可。因此以长臂猿作为获得TCGF-CM的来源，无疑是较理想的。测定分子量一般用两种方法，即聚丙烯酰胺电泳(SDS—PAGE)和凝胶过滤法。由于采用的方法不同，测得的结果也不完全相同。由于蛋白质具有聚集作用(Aggregat— ion)，因此用凝胶过滤法测得的分子量较高‘¨。人的TCGF用SDS-PAGE测得为15KD左右，而用凝胶过滤法为22—25KD，在DEAE柱洗脱的活性峰为70mMNaCl。我们测得猿的TCGF分子量为22—24KD，DEAE洗脱峰为75mMNaCl。因此，猿和人的TCGF极为相似。采用750m1MLAl44—CM获得的纯化TCGF，粗略估计为1一lO,ug(参阅了数个实验室纯化的各种不同来源的TCGF的产率)。目前所纯化的制剂中仍混杂有0．0s％的小牛血清蛋白。如能改用无血清的培养液获得的MLAl44—CM作为纯化TCGF的来源，可望能进一步提高纯度。但TCGF在无血清中极不稳定，用无血清的培养液获得的纯化制品，其活力只能保持一周，因此必须加入少量(0．25％)的BSA才能匣活性稳定数月”，。因此，根据各种具体实验对TCGF纯度的要求，可试用各种纯化方法。参考文献1．Cra二e!㈠—P呻?r口OI， ct a1．J三＼p＼[cd1981：154：422．2．He：dersOnL￡， cr a1．JImmunO：1983；131：810．：．灵易三。中华微生广学勺免疫主条亡198i年：+：69，4．谢大力．等．中华按苎物中和兔疫中杂丰(待发表)。；．FarrarJJ，et aI．JImmuOOl1978；121：1353．6．MierJ＼Y andGa㈠oRC，JImmu：128：1122．7．Schwuler9U．㈠um9nL?mphOk；ne1982；S：．8．Ru5celr：FW， et a1．Biu!u小c引Rc5pOcse5 inCance，1982；l：121．9．MierJ＼Y andGallORC．P／ocNar—＼cad`9：1980：77：6134．Pu厂ificatiOnOfTCGF fromMLA一144CellLilieWuYl-yuanYangYiZhangJun(Cancer／natitute，ChineseAcademyO／MedicalSciencee，Bei／／rig)ChenWel-feng(Bei／{n夕Med{caiCollege，Bei／ing)GibbOⅡTCGF has bee辽pur“ied approximately200 fO]d from aT1ymPhoma cell门neMLA一144 cOnditiOned media by usiⅡS ammonium sulfate precipitation，a sequeⅡceOf iOn exckaⅡge ehrO一皿atography withDEAE—Sephacel andZel filtrat{oⅡw“hUltrogeIAcA54．A molecu[af weight22-24KD has been estimated fromSel filLra“On studies．—＼sOall amOu口tOf crudcTCGF p了epa— ra“On cOuld be partially puri[ied by this method．