抗病毒多肽疫苗临床研究现状①薛冰肖长义叶红②(三峡大学医学院，宜昌)中国图书分类号R392．1文献标识码A文章编号自20世纪80年代Strohmaier等11j人发现口蹄疫病毒(FMDV)的146～154及200～213氨基酸肽段含免疫学位点，从而找到了一种新型疫苗，即肽疫苗。多肽疫苗安全性好，不具备传染疾病的危险，具有高度的特异性，价格低廉，易于保存和应用，且随着分子免疫学、分子生物学和现代生物工程技术的发展，近年来成为疫苗研究的热点。目前上百种肽得到发展，数十种肽疫苗已进行临床试验阶段E21。主要集中在人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒3种抗病毒多肽疫苗研究方面。1卸Ⅳ(Human immunodeficiency virus)多肽疫苗的研究现况艾滋病继续在全球蔓延，根据UNMDS／WHO2007年最新统计数据显示，仅2007年即新增250万感染者，约210万成年人和儿童因HIV感染而死亡。教育和行为规范是控制HⅣ流行的重要因素，同时HⅣ疫苗的研发亦成为当下迫切需要。尽管对于HIV疫苗的研究已经过去20多年，目前还没有一种应用于临床，但临床前试验已取得巨大进展。虽然抗H1V免疫保护的具体相关因素还没有确定，多数专家均认为有效的HⅣ疫苗应该引发体液和细胞免疫应答l3I。HIV肽疫苗具有引发CD4+和CD8+细胞免疫应答的能力，在复合抗原或抗原混合物的外表面显露的肽可能诱发亚优势表位应答，HIV基因的肽代表区也已经被确定HJ。HⅣ一1基质蛋白p17(matrix protein p17)与病毒复制有关，其不同的免疫调制性质与病毒发病机制①本文受国家F；I然科学基金项目()、湖北省卫生厅资助(No．-％lJ科[2006]97号JX3832)及湖北省教育厅重大课题资助(No．鄂教科[号Z)②湖北省宜昌市中心人民医院，宜昌作者简介：薛冰(1982年一)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫学方面研究，E—mail：201lhuebing@163．corn；通讯作者及指导教师：肖长义(1958年一)，男，教授，博士生导师，主要从事病毒感染与免疫学方面的研究，E．mail： xiaoehy@(：tgLl．edu．en。，史垦丝蕉堂苤查!螋生笠堑鲞1000-484X(2009)11-1050-05有关，是HⅣ一1中和抗体的靶位，p17抗体的水平高低与AIDS的进展缓急有关。事实上已经显示p17在体外可加强H1V一1的复制，负性调节CD4+T细胞，NK细胞，树突状细胞，单核细胞的激活、分化及增殖。最近还发现在HIV一1感染者血清中可以检测到p17，且持续存在于病人的淋巴结中bJ。因此，HIV一1基质蛋白p17成为抗艾滋病治疗性疫苗的候选抗原。FiorentiniS等L6J合成了针对HW一1 p17的多肽，用这个由20个氨基酸(SGGELDRWEKIRL—RPGGKKK)组成的合成肽(命名为A脚)结合载体蛋白钥孑L戚血蓝素(KeyholeLimpetHemocyanin，w-I)共同免疫BALB／c鼠，产生抗AT20的中和抗体，抗体滴度超过1：，其可终止所有病毒蛋白的生物学活性。由于艾滋病肽疫苗面临的主要挑战是HIV一1株的多样性，为了评估AT20一KIk-I作为广谱候选疫苗的能力，FiorentiniS等_7j从乌干达人HIV一1A和C亚型中抽取4例不同的重组体p17蛋白(含AT20表位突变点)，使用该肽疫苗进行效果评价。结果发现尽管AT20表位存在突变点，p17依然能与其受体p17R结合，在1：50血清稀释度检测到相同的生物学活性。令人惊奇的是，AT20．KLH产生的抗体既能识别线性表位(aa9～22之问)，又能识别构象表位。AT20一KLH的这些临床前免疫研究数据为肽疫苗的I期临床试验提供了研究基础。KranAM等旧J使用Vacc一4x肽疫苗，基于HIV．1核心蛋白p24共有序列基础上的四个水溶性肽(长度为24～27个aa)组成，免疫40位HIV阳性患者。整个免疫过程中无一例发生严重不良反应，患者在体力状态、生命征象和安全参数方面均未改变。同时，体外诱导T细胞增殖试验(16位病人未被免疫，作为阴性对照)：在12周，11位患者中9位(81％)检测到Vacc一4x特异性增殖反应；在26周，25位患者中20位(80％)持续存在特异性增殖反应，而未免疫组16位中仅5位(31％)产生弱的免疫应答。该研究显示了候选肽疫苗Vacc．4x在大多数病人中能安全诱导HIV相关性T细胞应答。Nehete等旧J用猴一人具有抗原性的8个高度保匪鲨笠煎题垂玺然壅茧I壶盎婴塞堡丛箜!!塑守HIV一1被膜肽组成联合肽疫苗(Peptide．cocktail vaccine)，该疫苗通过FMOC固相法在肽合成仪上合成，纯度超过95％，免疫印度起源猕猴，通过酶联免疫吸附试验检测到特异性的IFN—y诱导细胞和T细胞增殖，启动强的细胞免疫应答。PialouxG等_1 o_用H1V六脂肽疫苗(threeNef，twoGag，and oneEnv lipopeptide)分别在0、3、6周免疫24位H1V．1感染者，23个患者中16个(70％)对HIV一1肽中的至少一种产生CD4+T细胞增殖反应，13个(57％)检测到CD8+T细胞应答，90％的患者对HIV一1肽中的至少一种获得CD4+和／或CD8+反应。HⅣ肽疫苗由于弱的免疫原性使其发展受限，寻求并确定HIV肽疫苗的最佳佐剂以增强免疫原性成为必要，如制备的细胞因子c4。V3HⅣ肽疫苗已确定能增强机体的体液免疫应答L11I。同样地，GM—CSF通过吸附巨噬细胞诱导其成熟，增强抗原递呈作用来加强免疫应答，同时具有增强乙肝疫苗和利什曼原虫疫苗的应答活性。在临床试验前研究中，GM。CSF与HⅣDNA，病毒样颗粒或活病毒体疫苗联合，均显示好的佐剂效果。Spearman等l12J对多表位肽(Muhiepitope peptide，MEP)疫苗的免疫原性进行评估，这是HⅣ候选疫苗在人体上的首例研究。HIVCTL多表位肽(MEP)疫苗是由4个CTL多表位肽与油水相乳剂(RC529一 sE)，加或不加GM—CSF辅佐剂组成。这4种肽被指定为A、B、C和J，范围在aa27～47之问。2004至2005年美国的7个区96位受试者参与了本试验，年龄在18～50岁之问。分别在0天、28天、84天给予3种剂量组，其中40位接种CTLMEP／RC529．SE，40位接种CTLMEP／RC529一SE+GM—CSF，16位给予生理盐水作为控制组，追踪随访15个月。第一次免疫后2周应答率较低，CTLMEP／RC529一SE组7．5％，CTLMEP／RC529一SE+GM—CSF组7．9％。第三次免疫后2周两组均达到92％，98天时达100％。98天时在不加GM—CSF组和加GM—CSF组中CTLMEP特异性抗体应答中位数分别是8569和，具有统计学差异。2HCV(HepatitisC virus)多肽疫苗的研究现况目前全世界估计有1．7亿人感染HCV(HepatitisC vires)，每年新增感染人数达300～400万，持续的HCV感染最终导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌，严重危害人类健康，近年来针对HCV合成的疫苗尤其肽类疫苗取得的发展与效果，显示其可以成为解决HCV感染的良好途径。Yutani等113J对12名HCVlb(+)的患者免疫接种HCVlb衍生肽，评价肽疫苗的安全性和免疫应答效果。4个疫苗候选肽接种于HLA—A24(+)患者，诱导产生CTL和体液免疫应答。这4种不同的合成肽是从HCVlb的高度保守区获得的：蛋白El衍生肽，位于aa213～221(E1213～221，VYEAADMIM)；蛋白E2衍生肽，位于a3488～496(E2488～496，HYAPRPCGI)；非结构区3衍生肽，位于a,a1081～1090(NS～l090，VYHGAGSKTL)及非结构区5A衍生肽，位于aa2132～2140(NS5A2132～2140，RYAPACKPL)。皮下注射肽，24小时后皮肤硬结>5 mill或红斑>10 mIYl作为阳性对照，用HIV肽作为阴性对照。每两周一次注入患者腹部皮下，一个周期接种7次，所有12名患者至少接种2个周期，分析肽的安全性和免疫原性。整个研究过程没有发现严重的细胞毒性反应，肽疫苗接种剂量与症状起始和持续时问没有相关性，患者对该疫苗具有极好的耐受性。接种0．3 mg、1 mg和3 mg肽观察到分别有1／4、1／4和3／4的患者对肽产生了特异性的CTL反应；相应地，检测到有0／4、3／4、3／4的患者IgG抗体滴度增强，即剂量越大，免疫效果越强，为剂量依赖性。这一结果为进一步临床研究提供了很大支持。由于HCV感染T细胞反应微弱，且被膜抗体在慢性感染患者和动物试验中不能产生相应的中和反应，FirbELs等…设想建立由表位特异性CD8+CTLs和CD4+反应所致的抗HCV免疫应答效果会更佳，若使用特征性表位包括大部分HLA—A2限制性表位的疫苗也将更具优势，基于上述假设合成的IC41肽疫苗便具有这一特性。IC41包含至少4个HLA．A2限制性CTL表位及3个高度泛宿主性的CIM+辅助T细胞表位，以多聚一I，精氨酸作为IC41佐剂。在一组随机的、安慰剂控制下的试验中，对128位HLA．A2阳性健康志愿者给予4次皮下注射，7个不同剂量。结果显示IC41安全，具有极好的耐受性，轻度到中度的局部注射反应是暂时的，且所有剂量组对IC41均能诱导产生特异性的免疫应答。检测CD4+T细胞增殖反应，接种0．5mgIC41+多聚精氨酸，应答率达8％～25％；接种2．5 mgIC41+多聚精氨酸，应答率达25％～42％；接种5 mgIC41+多聚精氨酸，应答率约50％。检测CD8+T细胞增殖反应，接种0．5 mgIC41+多聚精氨酸，应答率约8％；接种2．5 mgIC41+多聚精氨酸，应答率约25％；接种5 mgIC41+多聚精氨酸，有超过40％的志愿者产生CD8+免疫应答。即接种剂量越高，免疫应答越强。同样地，在健康志愿者中已安全诱导产生特异性的能分泌干扰素7(IFN．7)的CD4+和CD8+T细胞。KladeCS等¨5J采用双盲法，随机抽取60名对经典治疗无效或治疗后复发的HLA．A2阳性的慢性丙肝患者，分成5组，观察IC41、单纯HCV肽疫苗、单纯多聚精氨酸免疫后的反应差别。结果发现IC41耐受性好，无药物依赖性。在IC41疫苗组中T细胞增殖达67％，相较于单纯用肽疫苗的17％的明显增高；IFN．7酶联免疫试验其应答率为42％。研究表明HCV肽疫苗IC41对慢性丙肝患者能诱导产生有效的特异性Thl／Tcl应答。ChuaBY等_16J通过CD4+T辅助细胞表位(序列为I(IJIPNASLIENC‘IKAEL)经一个赖氨酸残基插入结合CD8+T细胞表位(来自流感病毒A基质蛋白aa58～66，GIIGFVFTL)合成一种脂肽。这种含二棕榈酰硫甘油半胱氨酸类脂的脂肽(它是树突状细胞表面Toll样受体2的配体)，能诱导产生有效的CD8+T细胞应答，在健康人群与HCV感染者中均能活化DC并分泌IL一12p70，活化CD8+T细胞产生IFN一7。这种脂肽疫苗可通过诱导抗HCVCD8+T细胞应答来清除慢性患者体内的病毒。3HPV(Human papillomavirus)多肽疫苗的研究现况宫颈癌在妇女常见肿瘤中位列第二，约80％出现在发展中国家。每年约25万妇女死于宫颈癌，新增病例50万。近年来，HPV多肽疫苗无论在动物试验还是临床试验中都取得令人鼓舞的进展。Daftarian等¨7J使用脂质体抗原呈递系统(Vacci。Max，VM)对一个肽疫苗进行临床前试验。该肽疫苗是将HPVl6E7 aa49～57肽RAHYNlVTF(R9F)(包含一个CTL表位)与通用辅助T细胞表位(PADRE)融合，结合佐剂CpG或脂质体。此肽被指定为假阳性(False positive，FP)，疫苗使用剂量为50『上g／单剂量。将50×zos个表达HPV的C3肿瘤细胞接种C57BL／6鼠，4、5、6、9、14天后给予皮下注射FP—CpG—VM疫苗。所有接种了该疫苗的鼠在试验终止时第130天均无肿瘤生长，经细胞毒性分析，酶联免疫斑点试验和INF．y检测均显示产生了针对选择性CTL表位的特异性免疫应答。同样的方法，接种60×105个HPV肿瘤细胞，4个月后测定细胞毒性，发现只有接受FP—CpG—VM疫苗的小鼠脾细胞具有溶解活性。这些结果显示该疫苗对表达肿瘤的HPVF7蛋白能产生强而持久的特异性免疫应答。史国鱼蕉堂苤查!塑生箜堑鲞不仅在动物模型，将HPV肽疫苗应用于人体试验依然产生积极的效果。有证据表明抗Ll抗体能有效识别宫颈损伤和正常宫颈。Urquiza等人[18．|发现位于Ll表面暴露区的肽(55PI、『NI呱ILⅥ'KV—SGLQYRVFR74)和(284LYIKGSGS‘rANLASSNYF tqB00)能与来自宫颈损伤病人血清中的抗体发生特异性的中和反应。使用这两个肽与165名正常妇女血清和148名有宫颈损伤或宫颈癌患者的血清发生反应，经EHSA方法进行结果分析。不到3．6％的正常妇女血清能识别此两肽；相反，9l％～96％的宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia，CINI～CINIII)或宫颈癌患者血清能识别这两个肽。这些数据显示患者血清中的抗肽和抗体与HR—HPV存在密切相关，并且发现识别癌前期和宫颈癌的敏感性达92％～97％，特异度达89％～95％，且特异性免疫应答效果比病毒样颗粒更强_l9|。由这两个肽所制备的抗体对于展开大规模的宫颈癌筛查可能具有重要意义。Sarkar等旧J根据两性分子结构和相关T细胞表位从HPVl6E6和E7蛋白中选择7个E6肽序列和8个E7肽序列，通过固相法合成肽，用这些肽去免疫患者，对免疫效果进行评价。研究对象共69人，分为4组：1组6人，为正常组，C1N(一)／}Ⅱ)V(一)；2组31人，C1N(+)／HPv(+)；3组和4组均为C1N(+)／HPV(+)，在参与实验之前6个月进行了CIN消融或切除手术，3组22人，为未复发组Recur(一)，4组10人，组织学再发CIN，Recur(+)。结果显示使用单一肽，第1组无一例，第2组31人中5例产生单核细胞增殖反应，第3组的大多数病人对所有7个E6肽和7／8E7肽产生增殖应答，刺激指数(Stimulation index，SI)≥3．0，第4组10人中4例产生增殖应答；而使用合成肽，第3组64％的患者对E6合成肽产生增殖应答，82％的患者对E7合成肽产生增殖应答，86％x；J-E6或E7合成肽中的至少一种产生明显增殖反应，而第4组无1例对E6／E7产生增殖反应。这些结果显示引发的特异性细胞免疫应答对宫颈癌治疗后无复发患者具有重大意义。因此这些肽对CIN痊愈患者获得保护性免疫起到指示剂的作用，极具潜力设计成CIN相关的HPV预防性和治疗性免疫试剂。徐道华等121_基于表位设计疫苗(Epitope-base vaccine design，EBVD)的技术路线，以HPVE7抗原86～93表位为基础，合成了CTL、Th和脂类分子组合的模拟多肽抗原P1(TIGIVCPI)，同时合成了CTL、 n表位组合的模拟抗原肽P2(TLGIVCPI)和单纯’}j冰牧等人宅乜行对免疫功能的影响第lI期 fiI¨I)wi。峭s}miI—vs h“g—tlLIraIi‘”15I’a‘‘P11i}dlf lJAviⅢs}1a(。f’Erlvin)11Mc‘J，2()08：79(9)：835—843．2617【：uh印iF．¨P山’v1．鼬‘-ss8ys㈣l 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